程亦凡谈冷冻电镜技术发展

如果在两年前，我们说冷冻电镜（cryo-EM）是结构生物学研究的重要工具，很多人都应该不以为然。毕竟虽然冷冻电镜和X射线晶体学、核磁共振被称作结构生物学研究的三大利器，但不得不承认冷冻电镜是三者当中最弱的一种技术手段，在现在已解析的一千多种膜蛋白结构当中，90％以上都采用的是X射线晶体学方法，而核磁共振在小分子量的蛋白结构解析中也发挥了重要的作用。
　　
　　然而2013年12月5日，美国加州大学旧金山分校副教授程亦凡与同事David Julius两个实验室合作，采用单电子计数探测器，以近原子分辨率（3.4埃），确定了在疼痛和热知觉中起中心作用的一种膜蛋白TRPV1的结构，这一振奋人心的成果让研究人员们开始重新审视冷冻电镜在结构生物学研究中的所能发挥的作用。毕竟和X射线晶体学方法相比，它所需的样品量很少，也无需生成晶体，这对于一些难结晶的蛋白质的研究带来了新的希望。
　　
　　日前，在“2014冷冻电镜三维分子成像国际研讨会”召开期间，仪器信息网编辑特别采访了前来参加会议的程亦凡，请他介绍了研究所用的新型探测器件对提升冷冻电镜分辨率的影响，冷冻电镜技术的发展是否意味着X射线晶体学时代的结束？冷冻电镜未来的发展方向及需要关注的问题？
　　
　　美国加州大学旧金山分校副教授程亦凡
　　
　　采用直接电子探测技术使冷冻电镜的分辨率达到近原子分辨率水平
　　
　　尽管人们早已认识到，冷冻电镜有潜力达到原子级别的分辨率，但现在要实现这一点还面临着许多的挑战。在程亦凡的研究中，他的实验室参与了对冷冻电镜所用的相机进行的改进，和单电子计数探测器的研发。单电子计数探测器是一种直接电子探测器件，能够直接检测电子，而不需要像传统CCD相机那样先将电子转换成光子，然后再转化为光电子进行探测。
　　
　　程亦凡介绍说：“传统的CCD相机的DQE（检测量子效率）在低频仅为30％左右，高频则更低，严重影响了高分辨率信息的采集。因而研发新的探测器来提高分辨率是冷冻电镜研究的一个重要课题。这方面的研究主要是由我在UCSF的同事和合作者David Agard教授，以及英国MRC的Richard Henderson教授，和UCSD的几位教授推动的。他们在很多年前就都预见到相机开发对电镜技术是一件很重要的事情。可以说David Agard非常有远见，他预见到单电子计数的重要性，并决定要和Gatan一起做单电子计数探测器，而其他几家公司觉得单电子计数很难有实际应用。”
　　
　　“从2010年开始，三年多的时间里，我们和Gatan公司及Lawrence Berkeley国家实验室合作，在看不到前景的情况下，我们不断的摸索。最终通过快速读取与几乎无噪音的电子计数组合，将相机的检测量子效率提升到70％。通过实验，我们也找到了单电子计数相机的最佳使用条件，并结合软件算法的改进，使图像模糊得以校正，实现了近原子分辨率。”程亦凡说道。
　　
　　目前，这种单电子计数相机已经由Gatan商业化，即K2 Summit Direct Detection Camera。其他两家公司（FEI和Direct Electron）也推出了直接电子探测相机，但都不是单电子计数。据介绍，直接电子探测相机的价格都比较贵，对任何一个单位来说都是一笔很大的投资，如果要推广，价格将是一个很关键的限制因素。“但是现在看来，有没有直接电子探测相机几乎决定一个电镜实验室有没有机会在激烈的竞争之中站有一席之地。就像在一场球赛中决定你是在场上参加比赛的球员，还是在场外的观众。这对那些现在还没有装备这类相机的电镜实验室产生了很大的压力。”程亦凡说。
　　
　　冷冻电镜的发展是否意味着X射线晶体学时代即将结束？
　　
　　不用结晶直接解析蛋白质结构，并达到近原子分辨率，这无异于是一场革命。那么，冷冻电镜技术的发展是否意味着X射线晶体学时代即将结束呢？在程亦凡看来，现在不会，将来也不会。
　　
　　他说：“就目前来说，虽然冷冻电镜的分辨率有了很大的提升，比如我们可以看清小分子与蛋白质间的结合位点，但还无法看清楚小分子和蛋白质是如何结合在一起的。这一点，冷冻电镜和X射线晶体学技术相比还是有差距的。现在冷冻电镜技术的发展已经引起做基础研究的人的兴趣，但制药公司还在观望当中。如果冷冻电镜的分辨率能达到2埃左右，那对于药物设计和筛选就非常有帮助，而且制药公司在研发方面的投入远远大于基础科研，如果他们认可这一技术，将带来很大的市场。现在应用X射线晶体学技术的实验室，将来都会用到电镜技术。这样的话，很多科研单位和制药公司不会只配置一台电镜，而会是几台电镜配套。同时他们对于冷冻电镜人才的需求相应也会加大。和X射线晶体学相比，冷冻电镜实验室培养的学生还太少，远不能满足需求。”
　　
　　“而未来，一个实验室只掌握单独的一样技术是不够的，结构解析当中，我们可以用不同的方法来做，没有固定的模式，就看哪条路走的快了。此外将来的结构生物学研究，不再仅是解析结构，而是更加注重解决实际的生物学问题。生物学问题的系统性和复杂性需要我们从各个方面，结合各种技术来解决，单一的技术肯定是不够的。所以，随着冷冻电镜技术的发展成熟，它会和X射线晶体学成为结构生物学研究中相辅相成的技术手段，而不是将其取代。”程亦凡说道。
　　
　　冷冻电镜的发展还需要解决和关注哪些问题？
　　
　　对于冷冻电镜发展需要解决的问题，程亦凡表示主要是进一步提高分辨率，以及形成流程化的操作。
　　
　　程亦凡说：“虽然和过去相比，冷冻电镜的分辨率有了很大提升，但目前还是徘徊在3埃左右，仿佛有一堵看不见的墙，如果能进一步突破达到2埃左右，将是一件非常有挑战和令人激动的事情。但我们现在还不知道具体是什么原因限制了分辨率的提升，仪器、相机、样品制备、软件等的改进都可能带来新的突破。”
　　
　　对于要形成流程化操作，程亦凡这样说道：“目前电镜还没有像X射线晶体学那样形成流程化的操作，一个实验室想在1-2年内熟练掌握这一技术很难。我们希望在今后3-5年内，能将冷冻电镜形成流程化的技术，降低进入这一领域的技术门槛，让更多的人能接受和了解，这样冷冻电镜技术才能真正推广开来。”
　　
　　采访中，程亦凡特别对冷冻电镜研究圈子的文化氛围提出了自己的担忧和看法。他说：“技术的发展对于文化的冲击是很大的，有时我们可能没有意识到它。目前，X射线晶体学和冷冻电镜这两个领域的文化就非常不同。X射线晶体学技术比较成熟，因而每个样品的研究周期比较短，竞争也非常激烈，大家相互间的交流就很少，各自的研究内容在发表前也都是保密的。而冷冻电镜领域，在过去十几年间，我们彼此都大概知道每个实验室在研究什么，然后尽量避免研究同样的东西。这样做一是由于领域小，大家相互间都比较友好；另外更主要的是冷冻电镜的研究周期比较长，如果有人已经开始做，后来的人想超过很难。”
　　
　　“但现在随着冷冻电镜技术的发展，整个研究周期已逐渐变得越来越短，如果一个人在做，另一个人看到后做些改进很有可能就先出成果，这也导致电镜领域的人越来越谨慎保密了。保密在某些方面是必须的，但也会成为阻碍技术发展的障碍。面对这种现实的趋势，我们如何在适应的同时又不失我们固有的优秀文化传统，这确实是一个挑战。”
　　
　　最后，当问及接下来关注的研究课题时，程亦凡表示：“我自己的兴趣点还是膜蛋白或者说离子通道的研究。另外，我也希望做一些有挑战性的，其他人可能觉得做不了的研究课题。”
　　
　　此外程亦凡还特别提出对于冷冻电镜电子衍射技术非常感兴趣，并认为从事X射线晶体学研究的人一定要关注这一技术。他说：“在X射线晶体学研究中经常碰到的一个问题，就是晶体长不大，只能形成很小的晶体。目前解决这一问题的方法就是利用X射线自由电子激光，目前世界上只有日本、美国和欧洲三个地方有这种类型的光源，而光源建造和使用的费用都非常昂贵。现在我们利用冷冻电镜电子衍射法完全可以利用很小的晶体就进行结构解析，这是冷冻电镜技术的一个全新的应用领域，非常值得关注。”